如何减少和避免引物二聚体
1、(3)降低引物浓度。(4)减少循环次数。(5)提高退火温度。
2、在100摄氏度下的沸水中煮5分钟可使引物变为单链,以减少二聚体。不过有人认为在 PCR仪上95度变性5min也同样达到目的,而且成功试过通过延长退火时间也可以消除引物二聚体。
3、从PCR反应本身出发,建议适当的减少引物量、提高退火温度;如果是基于PCR产物,最好是挖胶回收,把你的目标片段特异的回收。
4、引物二聚体如果不影响产物的形成,是可以忽略的,但如果二聚体过多,导致引物与模板结合的特异性过差,可以用调整PCR体系的手段来解决,比如增加酶活性,减少引物使用量,添加enhancer等等。
5、不会,引物二聚体的产生原因是引物之间存在大量的碱基互补配对的情况,引物在PCR过程已被消耗,放置中不会新增二聚体。在PCR体系中减少引物用量,或者提高退火温度可减少二聚体的产生。
分子克隆PCR没有目的条带只有引物二聚体?
其实,如果序列没有什么特别的,只有引物二聚体的话,通常要么是模板,要么是引物设计出问题了。因为体系中没有匹配的序列供引物去识别和结合,只能形成二聚体了。
我认为你的引物浓度基本是合理的,而且引物浓度在一定范围内不会造成没有目的条带的现象。如果你是选用与外文文献相同的引物,可以参考他的反应条件,或者在他的退火温度上降低2-3度。
最大的可能是转基因植物失败了,可能你转烟草成功了。
两个原因:反转失败,模板里没有DNA;PCR失败,例如引物不行,退火温度不对等。这也没办法了,你先确定引物能不能从基因组里扩出条带。不过这种情况很可能是反转失败了。
引物是如何扩增形成引物二聚体的?
1、是引物的3端间相互错配扩增形成的。引物二聚体的出现是必然的,只是或多或少的问题,电泳时看不到引物二聚体带也不代表没有二聚体出现,只是含量低我们的肉眼看不到而已。
2、引物设计不合理,两条或一条引物的3`端有互补序列,造成自己配对延伸而扩增。建议重新设计引物,或者降低退火温度、增加模板和引物的量试下,不过能不能扩出来看运气了。
3、引物二聚体的产生原因是引物的3端间相互错配扩增形成,只有引物二聚体没有目的扩增产物原因有以下几点:1)主要需要优化引物设计,使用专业设计软件检查,避免引起二聚体的序列。
4、引物二聚体是引物3端不匹配放大形成的。 引物二聚体的出现是必然的,但这或多或少是个问题。电泳时引物二聚体带的缺失并不意味着没有二聚体,而是其含量低,我们肉眼是看不到的。
5、根本原因应该是RNA纯度不够,导致反转录的cDNA浓度低。
6、引物二聚体 引物二聚体的形成是最常见的问题之一。引物对之间的部分序列存在同源性时,可形成引物二聚体。
在做PCR时,出现引物二聚体
引物二聚体的产生原因是引物的3端间相互错配扩增形成,只有引物二聚体没有目的扩增产物原因有以下几点:1)主要需要优化引物设计,使用专业设计软件检查,避免引起二聚体的序列。
根本原因应该是RNA纯度不够,导致反转录的cDNA浓度低。
是在pcr反应中,两条引物上的互补碱基相结合形成的聚合体,这种聚合体出现了,就相当于原本可以扩增的原料链减少了,即会导致扩增的效率降低,所以最好能避免这种物质的出现。
不会,引物二聚体的产生原因是引物之间存在大量的碱基互补配对的情况,引物在PCR过程已被消耗,放置中不会新增二聚体。在PCR体系中减少引物用量,或者提高退火温度可减少二聚体的产生。
引物设计不合理,两条或一条引物的3`端有互补序列,造成自己配对延伸而扩增。建议重新设计引物,或者降低退火温度、增加模板和引物的量试下,不过能不能扩出来看运气了。
我把退火温度提高到了68度也没能把引物二聚体搞定,后来我想通了,可能我这对引物把其它序列扩增出来了,而且扩增效率很高(我一个同学设计了十几对才找到一对好用的)。
怎样消除引物二聚体
1、(3)降低引物浓度。(4)减少循环次数。(5)提高退火温度。
2、从PCR反应本身出发,建议适当的减少引物量、提高退火温度;如果是基于PCR产物,最好是挖胶回收,把你的目标片段特异的回收。
3、在100摄氏度下的沸水中煮5分钟可使引物变为单链,以减少二聚体。不过有人认为在 PCR仪上95度变性5min也同样达到目的,而且成功试过通过延长退火时间也可以消除引物二聚体。
4、引物二聚体如果不影响产物的形成,是可以忽略的,但如果二聚体过多,导致引物与模板结合的特异性过差,可以用调整PCR体系的手段来解决,比如增加酶活性,减少引物使用量,添加enhancer等等。